그람 염색

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그람 염색법(Gram staining, - 染色)은 1884년 덴마크의 의사인 한스 크리스티안 그람이 고안한 특수 염색법으로 세균류염색하는데, 크게 두 가지 방법이 있다. 대부분의 세균들은 세포벽의 구조에 따라 두 종류로 분류된다. 그람염색법에 의해 보라색으로 염색되는 세균을 그람 양성균이라 부르고, 붉은색으로 염색되는 세균을 그람 음성균이라 부른다.

염색 방법[편집]

과거의 그람염색법에 비해 현대의 그람염색법은 많은 면에서 개량되었다.

과거의 그람 염색법[편집]

허커(Hucker) 원법이라고도 한다. 표본을 아닐린수·겐티아나액(Gentian violet)으로 염색해서 아이오딘-아이오딘화 칼륨으로 매염 처리한 후, 에탄올로 씻어준다.

현대의 그람 염색법[편집]

허커(Hucker) 변법이라고도 한다. 과거의 염색법과 차이는 염색 시약을 겐티아나액(Gentian violet) 대신에 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 사용한다는 점이다. 세균을 슬라이드 글라스에 고정시켜 건조시키고 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 1~ 2분간 염색시킨 뒤 아이오딘-아이오딘화 칼륨에 1분간 고정시킨다. 이후 95% 에틸알코올을 이용하여 탈색시켜주고 이를 물로 씻어준 뒤 사프라닌등 붉은색 계통의 염색약으로 1 ~ 3분간 2차염색을 하고 물에 씻은 뒤 현미경으로 관찰하여준다.

염색 결과[편집]

그람 양성균의 경우 첫 번째 염색약이 에탄올 탈색 과정에서 씻겨나가지 않으므로 보라색을 띠고(두 번째 염색약보다 첫 번째 염색약이 더 진한 색이므로 두 번째 염색약은 이 경우 효과가 없다.), 그람 음성균의 경우는 첫 번째 염색약이 씻겨나가고 두 번째 염색약으로 염색되므로 붉은색을 띠게 된다.

주의 사항[편집]

그람 염색 시 그람 양성이 그람 음성으로 염색되는 경우가 있다. 강한 열처리, 지나치게 오랜시간 동안의 탈색으로 인해 CV-I결정이 펩티도글리칸을 빠져나가 사프라닌에 의해 분홍색으로 염색이 된다. 그리고 세균의 배양시간에 따라 정지기, 사멸기와 같은 상태의 세균들은 세포벽이 온전하지 못하므로 제대로 된 염색이 이루어지지 않아 음성으로 염색 될 수 있다. 이런 혼란을 방지하기 위해서 염색 시에 여러 조건을 필수적으로 준수해야 한다.

염색법의 원리[편집]

보라색으로 염색된 그람 양성균(좌), 분홍색으로 염색된 그람 음성균(우)

그람 양성균은 펩티도글리칸(세포 외피의 50~90%)으로 이루어진 두꺼운 그물코 모양의 세포벽을 가지고 있어 크리스탈 바이올렛에 의해 보라색으로 염색되는 반면, 그람 음성균은 더 얇은 층(세포 외피의 10%)을 가지고 있다.이 층은 자주색 얼룩을 유지하지 않고 사프라닌에 의해 분홍색으로 대조 염색된다. 그람 염색에는 네 가지 기본 단계가 있다.

  1. 박테리아 배양의 열 고정 도말에 1차 염색(크리스탈 바이올렛)을 추가. 열 고정은 일부 박테리아를 죽이지만, 대부분은 박테리아를 슬라이드에 부착하여 염색 절차 중에 헹구지 않도록 하는 데 사용된다.
  2. 요오드 첨가. 이 요오드는 크리스털 바이올렛과 결합하여 이 결합물을 세포 속에 가두는 역할을 한다.
  3. 에탄올 또는 아세톤으로 탈색.
  4. 사프라닌을 사용한 대조염색. Carbol fuchsin은 혐기성 박테리아를 더 강하게 염색하기 때문에 때때로 사프라닌 대신 사용되지만 대조염색으로는 덜 일반적으로 사용된다.

크리스탈 바이올렛(CV)은 수용액에서 CV+ 및 염화물(Cl-) 이온으로 해리된다. 이 이온은 그람 양성 세포와 그람 음성 세포의 세포벽을 관통한다. CV+ 이온은 박테리아 세포의 음전하를 띤 성분과 상호작용하여 세포를 보라색으로 염색한다.

요오드화물(I- 또는 I-3)은 CV+와 상호작용하여 세포의 내부 및 외부 층 내에서 크리스탈 바이올렛 및 요오드(CV-I)의 큰 복합체를 형성한다. 요오드는 종종 매염제로 언급되지만 CV-I 복합체의 제거를 방지하여 세포를 착색시키는 트래핑제이다.

알코올이나 아세톤과 같은 탈색제를 첨가하면 세포막의 지질과 상호작용한다. 그람 음성균은 외부 지질다당류 막을 상실하고 내부 펩티도글리칸 층이 노출된 채로 남아 있다. CV-I 복합체는 외막과 함께 그람 음성 세포에서 세척된다. 대조적으로, 그람 양성균은 에탄올 처리에서 탈수된다. 큰 CV-I 복합체는 펩티도글리칸의 다층 특성으로 인해 그람 양성 세포 내에 갇히게 된다. 탈색 단계는 매우 중요하며 시간을 정확히 맞춰야 한다. 탈색제가 너무 오래(몇 초) 방치되면 크리스탈 바이올렛 얼룩이 그람 양성 세포와 음성 세포 모두에서 제거된다.

탈색 후 그람 양성균은 보라색을 유지하고 그람 음성균은 보라색을 잃는다. 일반적으로 양전하를 띤 사프라닌 또는 염기성 푹신인 대조염색은 탈색된 그람 음성 박테리아에 분홍색 또는 적색을 주기 위해 마지막에 적용된다. 그람 양성 박테리아와 그람 음성 박테리아 모두 대조염색을 선택한다. 그러나 대조염색이 그람 양성균에서 안 보이는 이유는 더 어두운 크리스탈 바이올렛 얼룩 때문이다.

반응상[편집]

  • 그람 가변균(Gram-variable)

일부 박테리아는 그람 염색으로 염색한 후 그람 가변 패턴을 생성하며, 이 패턴은 분홍색과 보라색 세포의 혼합으로 보인다.[1][2] Bacillus, Butyrivibrio 및 Clostridium의 배양에서 성장 중 펩티도글리칸 두께의 감소는 그람 음성을 염색하는 세포 수의 증가와 일치한다. 또한, 그람염색을 사용하여 염색한 모든 세균에서 배양연령이 염색결과에 영향을 미칠 수 있다.[2]

  • 그람 불확정균(Gram-indeterminate bacteria)

그람 불확정 세균은 그람 염색에 예측 가능한 반응을 하지 않으므로 그람 양성 또는 그람 음성으로 결정할 수 없다. 예시로는 Mycobacterium bovis, Mycobactrium leprae 및 Mycobacterium tuberculosis를 포함한 많은 종의 Mycobacterium이 포함된다.[3] Mycoplasma 속의 박테리아는 세포막 주위에 세포벽이 없기 때문에 그람법에 의해 염색되지 않으며 세포벽 합성을 표적으로 하는 항생제에 내성이 있다. [4][5]

그람 염색법 의의[6][편집]

그람 음성균은 세포벽이 얇아 페니실린에 대한 반응성이 없다. 즉, 페니실린을 투약해도 효과가 없으며 크리스탈 바이올렛을 흡수해서 가지고 있지 못한다. 하지만 그람양성균은 페니실린으로 치료할 수 있다. 따라서 그람염색은 병원성 세균이 그람염색법에 어떻게 반응하는지 알게 한다. 따라서 병원균에 감염된 경우 어떻게 처리 할 것인지를 결정하는데 귀중한 자료가 된다.

각주[편집]

  1. Tim, Sandle (21 October 2015). Pharmaceutical Microbiology: Essentials for Quality Assurance and Quality Control. ISBN 9780081000229. OCLC 923807961.
  2. Beveridge, T J (1990년 3월). “Mechanism of gram variability in select bacteria”. 《Journal of Bacteriology》 172 (3): 1609–1620. doi:10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990. ISSN 0021-9193. 
  3. “HOLUM, JOHN R. Introduction to Principles of Chemistry. John Wiley and Sons, N. Y. 1969. $6.95.”. 《Science Education》 53 (5): 435–435. 1969년 12월. doi:10.1002/sce.3730530517. ISSN 0036-8326. 
  4. Lee, Elisabeth H.L.; Winter, Heinrich L.J.; van Dijl, Jan Maarten; Metzemaekers, Joannes D.M.; Arends, Jan P. (2012년 12월). “Diagnosis and antimicrobial therapy of Mycoplasma hominis meningitis in adults”. 《International Journal of Medical Microbiology》 302 (7-8): 289–292. doi:10.1016/j.ijmm.2012.09.003. ISSN 1438-4221. 
  5. Gautier-Bouchardon, Anne V. (2018년 7월 27일). “Antimicrobial Resistance in Mycoplasma spp”. 《Microbiology Spectrum》 6 (4). doi:10.1128/microbiolspec.arba-0030-2018. ISSN 2165-0497. 
  6. Eldon D.Enger. 《생명과학개론 13판 (Concepts in Biology, 13th Edition)》.