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녹아웃 마우스

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녹아웃 마우스(knockout mouse 또는 knock-out mouse) 또는 넉아웃 마우스는 연구자들이 기존의 유전자를 인공적인 DNA 조각으로 대체하거나 파괴하여 비활성화(또는 "녹아웃")시킨 유전자 변형 마우스(생쥐)이다. 이들은 염기서열이 분석되었으나 기능이 밝혀지지 않은 유전자의 역할을 연구하는 데 중요한 동물 모델이다. 특정 유전자를 마우스에서 비활성화시키고 정상적인 행동이나 생리적 차이를 관찰함으로써 연구자들은 그 유전자의 추정 기능을 추론할 수 있다.

마우스는 현재 유전자 제거 기술이 쉽게 적용될 수 있는 사람과 가장 밀접하게 관련된 실험 동물 종이다. 이들은 녹아웃 실험, 특히 인체생리학과 관련된 유전적 문제를 조사하는 실험에 널리 사용된다. 쥐에서의 유전자 제거는 훨씬 어려우며 2003년 이후에야 가능해졌다.[1][2]

최초로 기록된 녹아웃 마우스는 마리오 카페키, 마틴 에번스, 올리버 스미시스에 의해 1989년에 만들어졌으며, 이 공로로 그들은 2007년 노벨 생리학·의학상을 수상했다. 녹아웃 마우스를 생성하는 기술의 여러 측면과 마우스 자체는 여러 나라에서 사기업에 의해 특허가 등록되었다.

사용

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털 성장에 영향을 미치는 유전자가 제거된 실험용 마우스 (왼쪽)와 정상 실험용 마우스가 나란히 놓여 있다.

유전자의 활동을 제거하는 것은 해당 유전자가 일반적으로 하는 일에 대한 정보를 제공한다. 사람은 마우스와 많은 유전자를 공유한다. 결과적으로 녹아웃 마우스의 특성을 관찰하는 것은 연구자들에게 유사한 유전자가 사람의 질병을 일으키거나 기여하는 방식을 더 잘 이해하는 데 사용될 수 있는 정보를 제공한다.

녹아웃 마우스가 유용한 연구의 예로는 다양한 종류의 암, 비만증, 심장병, 당뇨병, 관절염, 약물 남용, 불안, 노화 및 파킨슨병에 대한 연구와 모델링이 포함된다. 녹아웃 마우스는 또한 약물 및 기타 치료법을 개발하고 테스트할 수 있는 생물학적 및 과학적 맥락을 제공한다.

매년 수백만 마리의 녹아웃 마우스가 실험에 사용된다.[3]

계통

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비만 모델인 녹아웃 마우스 (왼쪽)와 정상 마우스 비교

수천 가지의 다양한 녹아웃 마우스 계통이 존재한다.[3] 많은 마우스 모델은 비활성화된 유전자의 이름을 따서 명명된다. 예를 들어, P53 녹아웃 마우스는 세포 분열을 억제하거나 세포자멸을 유도하여 종양 성장을 정상적으로 억제하는 단백질을 코딩하는 p53 유전자의 이름을 따서 명명되었다. p53 유전자를 비활성화하는 돌연변이를 가지고 태어난 사람은 리-프라우메니 증후군을 앓게 되는데, 이는 어린 나이에 골암, 유방암 및 혈액암 발병 위험을 극적으로 증가시키는 상태이다. 다른 마우스 모델은 물리적 특성이나 행동에 따라 명명된다.

절차

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혼합 유전자형 주머니배 생산 절차
녹아웃 마우스 생산을 위한 교배 계획. 야생형 세포와 녹아웃 세포를 모두 포함하는 주머니배는 대리모의 자궁에 주입된다. 이는 야생형이며 주머니배 공여자와 동일한 색상(회색)을 띠거나 키메라(혼합)이며 부분적으로 녹아웃된 새끼를 낳는다. 키메라 마우스는 정상 야생형 마우스(회색)와 교배된다. 이는 녹아웃 유전자에 대해 흰색 이형접합이거나 회색 야생형인 새끼를 낳는다. 흰색 이형접합 마우스는 이어서 교배하여 녹아웃 유전자에 대해 동형접합인 마우스를 생산할 수 있다.

녹아웃 마우스를 생산하는 절차에는 여러 가지 변형이 있으며, 다음은 일반적인 예시이다.

  1. 제거할 유전자는 마우스 유전자 라이브러리에서 분리된다. 그런 다음 원래 유전자 및 그 인접 서열과 매우 유사하지만 유전자를 작동 불능으로 만들기에 충분하도록 변경된 새로운 DNA 서열이 조작된다. 일반적으로 새로운 서열에는 정상 마우스에는 없으며 특정 독성 물질(예: 네오마이신)에 대한 내성을 부여하거나 관찰 가능한 변화(예: 색상 또는 형광)를 생성하는 표지 유전자도 부여된다. 또한 완전한 선택을 달성하기 위해 헤르페스 tk+와 같은 두 번째 유전자가 구성물에 포함된다.
  2. [[주머니배|(아주 어린 배)]]에서 배아줄기세포를 분리하여 시험관 내에서 배양한다. 이 예시에서는 흰색 마우스에서 줄기세포를 채취한다.
  3. 1단계의 새로운 서열을 전기천공법으로 2단계의 줄기세포에 도입한다. 상동 재조합의 자연적인 과정을 통해 전기천공된 줄기세포 중 일부는 녹아웃된 유전자를 포함하는 새로운 서열을 원래 유전자 대신 염색체에 통합한다. 성공적인 재조합 사건의 가능성은 비교적 낮으므로, 변형된 세포의 대부분은 두 관련 염색체 중 하나에만 새로운 서열을 갖게 된다. 이들은 이형접합이라고 한다. 네오마이신 내성 유전자와 헤르페스 tk+ 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 상동 재조합을 통해 발생한 형질전환을 선택하기 위해 네오마이신과 간시클로버를 포함하는 용액에서 배양된다. 무작위 삽입을 통해 발생한 DNA 삽입은 네오마이신 내성 유전자와 헤르페스 tk+ 유전자 모두에 대해 양성 반응을 보이며, 헤르페스 tk+ 유전자의 산물은 간시클로버와 반응하여 치명적인 독소를 생성하기 때문에 모두 죽는다. 또한 유전 물질을 통합하지 않은 세포는 두 유전자 모두에 대해 음성 반응을 보이며 네오마이신 중독으로 인해 죽는다.
  4. 녹아웃된 유전자를 통합한 배아줄기세포는 1단계의 표지 유전자를 사용하여 변형되지 않은 세포로부터 분리된다. 예를 들어, 변형되지 않은 세포는 변형된 세포가 내성을 갖는 독성 물질을 사용하여 죽일 수 있다.
  5. 4단계의 녹아웃된 배아줄기세포는 마우스 주머니배에 삽입된다. 이 예시에서는 회색 마우스의 주머니배를 사용한다. 이제 주머니배는 두 가지 유형의 줄기세포를 포함한다: 원래 세포(회색 마우스에서 유래)와 녹아웃된 세포(흰색 마우스에서 유래). 이 주머니배는 암컷 마우스의 자궁에 이식되어 발달한다. 따라서 새로 태어난 마우스는 키메라가 된다: 몸의 일부는 원래 줄기세포에서 유래하고, 다른 부분은 녹아웃된 줄기세포에서 유래한다. 털은 흰색과 회색의 얼룩을 보이며, 흰색 얼룩은 녹아웃된 줄기세포에서 유래하고 회색 얼룩은 수용 주머니배에서 유래한다.
  6. 새로 태어난 키메라 마우스 중 일부는 녹아웃된 줄기세포에서 유래한 생식샘을 가지며, 따라서 녹아웃된 유전자를 포함하는 난자나 정자를 생산할 것이다. 이 키메라 마우스를 야생형 마우스와 교배하면, 그 자손 중 일부는 모든 세포에 녹아웃된 유전자의 한 복사본을 갖게 될 것이다. 이 마우스는 회색 마우스 DNA를 보유하지 않으며 키메라가 아니지만, 여전히 이형접합이다.
  7. 이 이형접합 자손들을 서로 교배하면, 그 자손 중 일부는 양쪽 부모로부터 녹아웃된 유전자를 물려받을 것이다. 이들은 원래의 변형되지 않은 유전자의 기능적인 복사본을 가지고 있지 않다(즉, 해당 대립유전자에 대해 동형접합이다).

녹아웃(KO) 마우스가 어떻게 만들어지는지에 대한 자세한 설명은 2007년 노벨 생리학·의학상 웹사이트에 있다.[4]

한계

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미국 국립보건원(NIH)은 이 기술의 몇 가지 중요한 한계점을 논의한다.[5]

녹아웃 마우스 기술은 귀중한 연구 도구이지만 몇 가지 중요한 한계가 존재한다. 유전자 녹아웃의 약 15%는 발달상 치사적이어서 유전자 변형된 배아가 성체 마우스로 성장할 수 없음을 의미한다. 이 문제는 종종 조건부 돌연변이의 사용을 통해 극복된다. 성체 마우스의 부족은 배아 발달로 연구를 제한하며 종종 인간 건강과 관련된 유전자 기능을 결정하는 것을 더 어렵게 만든다. 어떤 경우에는 유전자가 발달 중인 배아에서와는 다른 기능을 성체에서 수행할 수 있다.

유전자를 제거하는 것은 마우스에서 관찰 가능한 변화를 일으키지 못하거나, 심지어 동일한 유전자가 비활성화된 사람에게서 관찰되는 것과는 다른 특성을 생성할 수도 있다. 예를 들어, P53 유전자의 돌연변이는 인간 암의 절반 이상과 관련이 있으며 종종 특정 조직에서 종양을 유발한다. 그러나 마우스에서 p53 유전자가 제거되면 동물은 다른 조직에서 종양을 발생시킨다.

줄기세포가 유래된 계통에 따라 전체 절차에 변동이 있다. 일반적으로 129번 계통에서 유래한 세포가 사용된다. 이 특정 계통은 많은 실험(예: 행동)에 적합하지 않으므로, 자손을 다른 계통으로 역교배하는 것이 매우 일반적이다. 일부 유전체 자리는 제거하기 매우 어려운 것으로 입증되었다. 그 이유는 반복 서열, 광범위한 DNA 메틸화 또는 이질염색질의 존재 때문일 수 있다. 유전 물질의 녹아웃 부분에 인접한 129번 유전자가 혼재하는 현상은 "인접 유전자 효과(flanking-gene effect)"라고 불린다.[6] 이 문제를 다루기 위한 방법과 지침이 제안되었다.[7][8]

또 다른 한계는 재래식(즉, 비조건적) 녹아웃 마우스가 연구 중인 유전자가 없는 상태에서 발달한다는 점이다. 때때로 발달 중 활동 상실이 성체 상태에서 유전자의 역할을 가릴 수 있는데, 특히 유전자가 발달 전반에 걸쳐 수많은 과정에 관여하는 경우 그러하다. 이 경우 마우스가 정상적으로 발달하고 성숙한 후 관심 유전자를 제거할 수 있도록 조건부/유도성 돌연변이 접근 방식이 필요하다.

또 다른 심각한 한계는 야생형 동물에서 자연적으로 돌연변이가 발생한 후 진화적 적응이 녹아웃 모델에서 부족하다는 점이다. 예를 들어, 비타민 C를 합성할 수 없는 포유류에서는 GLUT1과 스토마틴의 적혈구 특이적 공동 발현이 보상 메커니즘을 구성한다.[9]

같이 보기

[편집]

각주

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  1. ↑ Pilcher, Helen R. (2003년 5월 19일). 《It's a knockout》. 《Nature》. doi:10.1038/news030512-17. 2014년 4월 3일에 확인함. 
  2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN (June 2003). 《Production of knockout rats using ENU mutagenesis and a yeast-based screening assay》. 《Nature Biotechnology》 21. 645–51쪽. doi:10.1038/nbt830. PMID 12754522. S2CID 32611710. 
  3. ↑ 가 나 Spencer, Geoff (December 2002). “Background on Mouse as a Model Organism”. National Human Genome Research Institute. 2014년 4월 3일에 확인함. 
  4. ↑ “The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007”. Nobelprize.org. 1985년 9월 19일. 2014년 4월 3일에 확인함. 
  5. ↑ “Knockout Mice Fact Sheet”. National Human Genome Research Institute. August 2015. 2014년 4월 3일에 확인함. 
  6. ↑ Gerlai R (May 1996). 《Gene-targeting studies of mammalian behavior: is it the mutation or the background genotype?》. 《Trends in Neurosciences》 19. 177–81쪽. doi:10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID 8723200. S2CID 33396039. 
  7. ↑ Wolfer DP, Crusio WE, Lipp HP (July 2002). 《Knockout mice: simple solutions to the problems of genetic background and flanking genes》. 《Trends in Neurosciences》 25. 336–40쪽. doi:10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID 12079755. S2CID 33777888. 
  8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (February 2009). 《Standards for the publication of mouse mutant studies》. 《Genes, Brain and Behavior》 8. 1–4쪽. doi:10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x. PMID 18778401. S2CID 205853147. 
  9. ↑ Montel-Hagen A, Kinet S, Manel N, Mongellaz C, Prohaska R, Battini JL, Delaunay J, Sitbon M, Taylor N (March 2008). 《Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C》. 《Cell》 132. 1039–48쪽. doi:10.1016/j.cell.2008.01.042. PMID 18358815. 

외부 링크

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녹아웃 마우스
관련 도서관 자료
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